PCR技术的基本操作和应用 知识点题库

（1） 常用技术来扩增获得的目的基因，该过程所需的原料是。从酶的角度阐述该技术和细胞内遗传物质复制过程的不同点是。

（2） 离体的胡萝卜组织细胞经过、两个阶段培育成幼苗。

（3） 微型繁殖无病毒胡夢卜时，常选取根尖作为外植体，其依据是。微型繁殖技术能保持品种的。

（1） 不同生物的基因可以“拼接”成功，从生物进化的角度说明；外源基因可以在不同物种的受体细胞内成功表达，说明了。人工合成的目的基因不能直接导入受体细胞，其原因是（答出两点即可）。

（2） 利用转基因技术培育抗虫番茄时，需要利用PCR技术扩增抗虫毒蛋白基因，可以根据序列合成引物。如图中A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取作为引物（DNA复制方向总是从5'向3'延伸）。将抗虫毒蛋白基因导入到番茄细胞最常用的方法是农杆菌转化法，该方法是利用Ti质粒上的T﹣DNA片段的功能。

（3） 人体的遗传性疾病很难用一般药物进行治疗，基因工程的兴起迎来了基因治疗的曙光。血友病是一种伴X染色体隐性遗传病，其基因治疗的基本思路是。

（1） 利用PCR技术对目的基因进行扩增时，利用的原理是。设计引物是PCR技术的关键之一，某同学根据已知的rhTPO基因的核苷酸序列设计的两对引物如下图所示，其中引物对（填“A”或“B”）设计不合理，原因是。

引物对A	P1   GTCCGCTAGTGGCTGTG P2   AGCTGGCGTTTAGCCTG
引物对B	S1   AAGCCGGGCGCGCGGAA S2   TTCGGCCCGCGCGCCTT

（2） HindIII和XhoI两种限制酶切割出的黏性末端不同，将含有rhTPO基因的DNA片段和质粒都通过HindIII和XhoI切割，可以避免。拼接成重组质粒时，需要加入酶才能完成。rhTPO基因能否在羊受精卵细胞中稳定遗传的关键是。

（3） 通常需要在胚胎移植前对早期胚胎进行性别鉴定，应从发育到时期的胚胎的中取样做DNA分析性别鉴定。

（4） 为了使rhTPO基因只在羊乳腺细胞中表达，在构建基因表达载体时需要在rhTPO基因前端加上。移植的胚胎可以在受体母羊中存活的原因是。

（1） 为构建人鼠嵌合抗体基因表达载体，需要对编码抗体不同片段的基因进行重组，为此应该从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取，经逆转录得到用于PCR扩增，并分别与人抗体的恒定区DNA序列拼接。

（2） 在PCR反应体系中需加入模板、4种脱氧核苷酸（4种dNTP）、、及缓冲液等。

（3） 构建人-鼠嵌合基因表达载体时，先将人抗体的轻、重链基因部分序列分别与相应鼠抗体的可变区序列整合后插入到两个启动子的下游。这过程需要将鼠抗体长链基因经和双酶切，鼠抗体短链基因经和双酶切。①是识别和结合的部位，它可以驱动相关基因转录。

（4） 将重组质粒导人中国仓鼠卵巢细胞后，可采用技术检验基因是否成功转录。通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，该嵌合抗体的优点是。

（1） 若用PCR技术扩增目的基因时，需要在PCR扩增仪中加入种引物，PCR技术的原理是。

（2） 在将目的基因导入水稻细胞前需要与质粒结合，以保证目的基因在受体细胞内，同时使。为了检测目的基因是否导入水稻细胞，可用放射性同位素标记的作为探针进行检测。

（3） 选取长势和数量相同的野生型水稻和，分别种植在含等量磷酸钙的甲、乙两块土壤中，在相同环境条件下培养一段时间后，测定比较土壤中的磷酸钙含量，若，说明转基因水稻培育成功。

（4） 将培育成功的转基因水稻植株移栽到大田，经可获得性状稳定遗传的转基因水稻植株。

（1） 用新冠病毒核酸序列信息，反转录合成了更稳定的S蛋白基因，此过程可以利用酶在体外将S蛋白基因大规模扩增。

（2） 构建基因表达载体时，还要给S蛋白基因的前后加上保证目的基因能转录。S蛋白基因表达载体在人造转录体系中转录时，除了加入S蛋白基因表达载体外，还需加入的物质有。科学家用磷脂分子形成的脂质体将mRNA包裹成纳米颗粒而形成mRNA疫苗产品。这种方法既能对不稳定的mRNA进行有效保护，又能。

（3） 疫苗是否能用于人群接种，必须先要评价其安全性和有效性。在一次临床试验中，实验组500人都注射了此疫苗，请写出进行有效性评价的思路：。

（1） 利用血细胞为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库。两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是基因组文库中含有该生物的全部基因，而cDNA文库中只含。获得的cDNA与细胞中对应的基因结构比较，缺少（至少答出2点）部分。

（2） 利用PCR技术可从人基因组中定点克隆出人凝血因子Ⅷ基因，实现定点克隆最关键之处是要设计。将PCR扩增得到的人凝血因子Ⅷ基因导入受体细胞时，科学家选用改造后的腺病毒作为运载体，你认为科学家选腺病毒作为运裁体的理由主要是：（答出2点）。

（3） 为证明获得的重组人凝血因子Ⅷ有医用价值，须确认重组人凝血因子Ⅷ与的生物学功能一致。研究发现，通过对人凝血因子Ⅷ的末端连接特定的短酞片段，能有效延长人凝血因子Ⅷ的半衰期，现欲通过基因工程生产改良后的人凝血因子Ⅷ，请写出这种技术的基本流程：。

（1） PCR反应的基本步骤是变性、、。

（2） 科学家研究发现DNA聚合酶只能催化方向的聚合反应。图1表示细胞内染色体DNA的半保留复制过程，有一条子链是先台成短的DNA片段（称为冈崎片段），再形成较长的分子，可推测参与以上过程的酶有DNA聚合酶、、。在PCR过程中无冈崎片段形成，原因是细胞内染色体DNA的复制过程特点是， PCR过程的特点是。

（3） 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与脱氧核苷三磷酸（dNTP）的结构如图2所示。已知ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。现有一些序列为5’- GCCTAAGATCGCA-3’的DNA分子单链片段，通过PCR技术获得以碱基“C”为末端（3’为碱基C）不同长度的子链DNA片段，将以上子链DNA片段进行电泳分离可得到种不同长度的子链DNA片段。为使实验顺利进行，在PCR反应管中除了单链模板、引物、DNA聚合酶和相应的缓冲液等物质外，还需要加入下列哪组原料（）。

A. dGTP、dATP、dTTP

B. dGTP、dATP、dTTP、dCTP、ddCTP

C. dGTP、dATP、dTTP、dCTP

D. ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP

（4） 以下为形成单链DNA后，再进行PCR扩增示意图。

催化①过程的酶是；核酸酶H的作用是。如果某RNA单链中一共有80个碱基，其中C有15个，A与U之和占该链碱基含量的40%，经过以上若干过程后共获得8个双链DNA，此过程中至少需加入G参与组成的核苷酸数量为（以上过程不考虑引物）。

（1） PCR技术扩增目的基因的前提是，以便根据此前提合成引物，引物的作用是。

（2） RT-PCR是以 mRNA为模板进行的特殊 PCR 技术，过程如图 1，该过程所需要的酶有和。

（3） 一定浓度范围内，模板浓度与 PCR 产物的浓度呈正比。在 RT-PCR过程中加入 TaugMan探针，原理如图 2 所示，Tag Man探针序列对应待扩增的目的基因的序列，在其5'端连接一个报告荧光基团（R），在其3'端连接一个淬灭荧光基因（Q）），探针完整时，报告荧光基团与淬灭荧光基团位置接近，发射的荧光被淬灭剂吸收，荧光强度很低。PCR 过程中 Tag 酶从5'端切断 Tag Man探针，释放荧光基团。根据荧光强度可对PCR 产物进行定量分析，原理是。根据 PCR 产物的浓度又可以估算的浓度，以此代表目的基因在特定组织中的表达量。

（4） 利用 PCR 技术，在引物的某个特定位点引入一个或多个不能与目的基因配对的碱基，就可以在目的基因中带来定点突变，据此获得的目的基因再经表达、纯化获得蛋白质，该过程属于（填工程技术）的范畴。

（1） 山楂果浆黏度大，含有丰富的果胶。为提高山楂果汁的产量，某兴趣小组从土壤中分离产果胶酶的微生物，并探究温度对果胶酶活性的影响，进行了下列实验。
Ⅰ.若要分离产果胶酶菌株，需配制以为唯一碳源的培养基，该培养基能分离目的菌株的原因是。
Ⅱ.将从果园采集的土壤放入适量的中，振荡混匀制成土壤悬液，备用。
①为获得均匀分布的单菌落，先将土壤悬液进行处理，然后将处理后的土壤悬液接种于（物理状态）培养基上。该方法也可用于测定产果胶酶菌的数量，但测定的菌体数量通常比实际值。
②由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。因此采用固定化酶技术，固定果胶酶时，将海藻酸钠和果胶酶的混合液注入CaCl₂溶液后，形成凝胶珠，若形成的凝胶珠偏大将导致使酶的作用效率下降。

（2） 干扰素是一种糖蛋白，具有抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。传统生产干扰素的方法是从人血液中提取，产量极低，治疗费用大。下图是科学家利用大肠杆菌生产人体干扰素的操作过程如下：

Ⅲ.若干扰素基因核苷酸序列是未知的，我们可以建立一个包括目的基因在内的，从中找到想要研究的目的基因。
Ⅳ.①过程表示在人体淋巴细胞中获得干扰素mRNA后，经过程获得干扰素基因甲。
Ⅴ.②③④过程表示利用PCR（反应）技术扩增基因甲（其中②表示在95℃下，双链DNA解旋成为单链DNA），请说出利用该过程进行DNA克隆不同于体内DNA复制的方面是（说出两点）。
Ⅵ.在利用甲、乙获得丙的过程中，常用两种限制酶同时切割甲和乙，避免发生，而获得更多的所需重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌之前，需用Ca²⁺处理，使细胞处于的生理状态，称为感受态。完成导入一段时间后，从大肠杆菌细胞中提取蛋白质，采用技术进行检测，若有杂交带出现则表明干扰素基因成功表达。
Ⅶ.与传统提取的干扰素相比较，利用大肠杆菌生产的干扰素缺乏糖链的原因是。