PCR技术的基本操作和应用知识点

1.原理：①在80-100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，称为复性（退火）
③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。
2.条件
①10倍浓缩的扩增缓冲液
②模板：单、双链DNA均可。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
③引物Ⅰ和引物Ⅱ：浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。
④耐高温的TaqDNA聚合酶：酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
⑤４种脱氧核苷酸的等量混合液，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，整个过程中要控制温度3.
3.过程
在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
复性：50℃左右时，引物与单链DNA结合。
延伸：在72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

4.实验操作
(1)PCR反应体系：

(2)实验步骤

PCR技术的基本操作和应用知识点题库

PCR技术通过对目的基因进行扩增，可以得到大量的目的基因，下面对该技术的叙述，正确的有(　　)
①遵循的基本原理是DNA半保留复制和碱基互补配对
②扩增仪内必须加入引物、原料和Taq酶
③每扩增一次，温度都要发生90℃

75℃

55℃的变化
④成指数式扩增，约为2ⁿ（n为扩增次数)

A . 一项 B . 二项 C . 三项 D . 四项

下面关于多聚酶链式反应(PCR)的叙述正确的是（）

A . PCR过程中需要引物，是为了使DNA双链分开 B . PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步 C . PCR过程中DNA合成方向是3'到5' D . PCR过程中边解旋边复制

新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术(或仪器)与应用匹配正确的是（）

A . PCR技术——扩增蛋白质 B . 杂交瘤技术——制备单克隆抗体 C . 光学显微镜——观察叶绿体的基粒 D . 花粉离体培养——培育多倍体植物

PCR技术扩增DNA,需要的条件是（）

①目的基因 ②引物 ③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖体

A . ①②③④ B . ②③④⑤ C . ①③④⑤ D . ①②③⑥

下列各项中不属于克隆的是（）

A . 试管婴儿的培育 B . “多莉羊”的产生 C . 用胡萝卜的韧皮部细胞培养植株 D . PCR扩增

基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作物的性状．通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分．多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR 技术．请回答：

（1）我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得、、延熟的转基因作物．

（2）引物是根据的一段核苷酸序列合成的，每种基因扩增需要一对引物的原因是．表是A、B、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要体现在．

A基因	引物1	5′GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3′
A基因	引物2	5′GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3′
B基因	引物1	5′TGAATCCTGTTGCCGGTCTT3′
B基因	引物2	5′AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC3′
C基因	引物1	5′CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3′
C基因	引物2	5′GCGTCATGATCGGCTCGATG3′

（3） PCR过程中温度从90℃降到55﹣60℃的目的是．
（4）检测人员通过多重PCR技术确定农作物中是否含有A、B、C三种转基因．将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图．据图分析：含有三种转基因的农作物是，判断依据是．
（5）与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是

金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理．PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过获得用于PCR扩增．
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的位点．设计引物时需要避免引物之间形成，而造成引物自连．
（3）图中步骤1代表，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环．
（4） PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键．退火温度过高会破坏的碱基配对．退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度．
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）．

资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体．请据图回答：

（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过酶的作用来完成的．通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循．
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是和．
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用¹⁵N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以¹⁴N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含¹⁵N标记的DNA分子数占全部DNA总数的比例为．

研究酶的化学性质和作用机理，有助于了解生命活动的规律并指导生产和生活实践．请冋答下列问题：

（1）甲、乙两种酶用同一种蛋白酶处理，酶活性与处理时间的关系如图1所示．甲酶的化学本质最可能是．
（2）在实际生产中，同定化细胞技术实质上固定的是．制备固定化酵母细胞时，常用的方法是上图2中[]（填数字序号及名称）．
（3）在生活实践中，酶制剂在洗衣粉中被广泛应用．某研究性学习小组为探究某品牌洗衣粉中酶催化作用的最适温度，设计了如下装置进行实验，并将结果用曲线图A、B表示（如图3）．
①使用该加酶洗衣粉的最适宜温度为．
②在0℃和75℃时，酶的催化效率基本都为零．但当温度再度恢复到45℃时，后者酶的催化能力已不能恢复，这是因为．
（4）在现代生物工程中，可用酶在体外处理“蛋白质一DNA复合体”以获得包裹在蛋白质中的DNA片段信息，过程如图4所示．
①a、b过程中，酶作叫的部位依次是．
②若将获得的DNA片段用PCR技术进行扩增，与细胞内的DNA复制过程相比，利用PCR技术扩增DNA时所需酶的不同之处是．

下列叙述正确的是（　　）

A . PCR技术利用了DNA双链复制的原理 B . 胚胎干细胞具有体积大，细胞核大，核仁小等特点 C . 卵子的发生是从初情期开始 D . 基因文库就是基因组文库

多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是( )

A . PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术 B . 反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板 C . PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增 D . 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变

医学研究发现，人体肝细胞中产生的抗凝血酶Ⅲ在抗凝血、防血栓方面具有重要作用。研究人员通过培育山羊乳腺生物反应器大量生产抗凝血酶Ⅲ。请回答下列问题：

（1）应从人的肝细胞中提取并分离mRNA，逆转录成单链DNA。根据已知的抗凝血酶Ⅲ基因的碱基序列设计特异性，经PCR和电泳，可得到大量抗凝血酶Ⅲ基因，此过程所用原料为。
（2）重组后的人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体由山羊β-酪蛋白基因启动子、抗凝血酶Ⅲ基因、标记基因和终止子组成，其中决定了人抗凝血酶Ⅲ基因只能在山羊乳腺细胞中特异性表达。
（3）山羊的ES细胞来自早期胚胎干细胞。在饲养层细胞上培养时，ES细胞具有的特性。将重组人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体包埋在由磷脂双分子层构成的脂质体内并转染ES细胞时，目的基因表达载体进入ES细胞的方式为。
（4）对山羊进行同期发情和超数排卵处理，得到代孕母羊和多个卵母细胞，当卵母细胞培养至时，可去核并移入上述ES细胞的细胞核，完成核移植。为选择雌性胚胎，可在囊胚时取细胞做DNA分析用以鉴定性别。检测羊奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ的方法是。

Anti基因是小型猪器官表面抗原基因，人工合成的reAnti基因的模板链与Anti基因的模板链互补。科学家利用合成的reAnti基因培育出转基因克隆猪，用于解决人类器官移植时免疫排斥。

（1）利用PCR技术对reAnti基因进行扩增，其原理是，在构建基因表达载体时，用两种不同的限制酶切割reAnti基因和运载体DNA来获得不同的黏性末端，原因是。
（2）猪胎儿成纤维细胞培养过程中，需要用酶将组织分散成细胞悬液。培育转基因猪时，应使用技术将含有reAnti基因的表达载体导入猪成纤维细胞。再将该转基因猪的细胞核注入时期的卵母细胞中，构建重组胚胎。
（3）胚胎培养液中除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指。
（4）用技术检测出转基因克隆猪的细胞核DNA中含有reAnti基因，但器官表面不含有抗原，原因是。

细胞的种类不同，特异性表达的蛋白质也不同，如效应T细胞可以产生干扰素，乳腺细胞可以分泌乳腺蛋白，膀胱壁细胞可分泌尿血小板溶素膜蛋白。其中效应T细胞产生的干扰素（IFN）具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。请回答下列问题。

（1）通过分析干扰素的氨基酸序列，可人工合成编码干扰素的序列，该序列（填“是”或“不是”）唯一的。利用PCR的方法对人工合成的干扰素基因扩增时，用方法使DNA变性。
（2）目的基因在血液中表达的转基因动物叫做血液反应器。由于某些物质进入血液会影响动物的健康，因此血液生物反应器比较适合生产（选填“胰岛素”“抗体”或“干扰素”中的一种或多种）。
（3）乳腺生物反应器的原理是外源基因与的启动子构建成基因表达载体，使干扰素基因在乳腺中表达，通过回收乳汁获得干扰素。
（4）膀胱反应器可将干扰素基因插入基因中，使干扰素分泌到尿液中。与乳腺反应器相比，膀胱反应器的优势表现在。

通过咽拭子取样进行RT-PCR技术检测是目前临床上诊断新型冠状病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸检测的RT-PCR试剂盒的部分工作原理简图如下。回答下列问题：

（1） RT-PCR是指以病毒的RNA为模板通过过程合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。进行RT-PCR过程中，需要加入的酶有（写出两种）。
（2）在PCR反应体系中应加入种引物，子链的合成方向
（3）将新冠病毒不稳定的RNA转换成DNA后，技术人员常采用荧光定量PCR技术定量检测样本中病毒的核酸含量。其原理如图，在PCR反应体系中每加入一对引物的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq 酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。反应最终的荧光强度与 PCR 起始状态的含量呈正相关。
（4）除核酸检测外，研究人员还研发了基于病毒蛋白的检测技术，该项技术的关键是生产出能与新冠病毒结合的特异性抗体。生产该种抗体的大致方案如下：
①向小鼠体内注射新冠病毒的抗原蛋白；

②分离免疫小鼠的B淋巴细胞，并与小鼠的骨髓瘤细胞融合，多次筛选、检测，最终获得所需杂交瘤细胞；

③将获得的杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，获得大量的特异性抗体。

上述生产抗体的方案中，步骤②中获得的杂交瘤细胞具有特点；步骤③中为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应采取的措施是。
（5）研究人员发现，某些情况下，新冠病毒可在不同动物身体内翻译出基本相同的多肽链，这是因为。

为探究M基因的功能，科研人员将克隆得到的M基因导入拟南芥植株（自交繁殖），流程如图所示。回答下列问题：

（1）通过过程a、b，采用法来获得了大量的M基因，过程b中需先加热至90~ 95℃然后冷却至55~60℃，冷却的目的是。
（2）为获得转基因植物，采用法侵染拟南芥的花序。基本过程如下。
①过程d：将重组质粒导入大肠杆菌，其目的是。

②过程e：将重组质粒导入农杆菌，再将含有重组质粒的农杆菌离心、富集，得到含有M基因的农杆菌液。

③过程f：在拟南芥植株产生大量花序时，将其花表面部分在农杆菌悬浮液中浸泡20~ 30s，3~4周后对转化拟南芥植株收种子（T₀）。浸泡之前，需先剪去已经长成的角果（这些角果将来可发育成种子），原因是。

④将收获的拟南芥T₀种子，播种在含有的培养基上，能健康生长的幼苗含有。
（3）采用农杆菌花序侵染的方法转化，一般只能将目标片段整合到一条DNA上。若要获得M基因稳定的突变体，需筛选出能稳定遗传的突变体。

近日，学术杂志《科学》在线发表了山东农业大学孔令让教授团队的重大学术突破成果。他们从小麦近缘植物长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病关键基因Fhb7，成功将其转移至小麦品种中并获得稳定的赤霉病抗性。孔教授团队在全球首次揭示了其抗病分子机制，找到攻克小麦赤霉病的“金钥匙”。回答下列问题：

（1）若用PCR技术从长穗偃麦草基因组中克隆出抗赤霉病关键基因Fhb7，需要在PCR扩增仪中加入种引物，其作用是
（2）检测抗赤霉病基因Fhb7是否成功导入小麦细胞的方法是，该项技术用到的基因探针的制作方法是：在上用放射性同位素等作标记。
（3）在深入研究的过程中，孔教授团队还发现了一个令人惊奇的科学现象——整个植物界没有发现Fhb7的同源基因，而在香柱内生真菌中发现了高度同源的基因。依据上述资料，推测长穗偃麦草中抗赤霉病基因Fhb7可能的变异类型是
（4）若用PCR技术获得Fhb7基因的同时，在该基因的两端分别插入限制酶EcoRI和BamHI的切点，尝试写出设计思路。

刍草是玉米是原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究D基因表达对卵细胞的影响，设计了实验。据图回答：

（1） D基因在大刍草卵细胞中不转录，从基因结构角度推测其可能的原因是卵细胞中。
（2）要构建大刍草的CDNA文库，应从大刍草中提取总RNA，原因是。由总RNA在相关酶的作用下获得D基因编码蛋白的序列。按如图所示构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上。
（4）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下大刍草卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明。

（5）在大刍草基因组中发现另一个B基因与其育性相关，为进一步研究B基因的功能，研究者将一段T-DNA插入到B基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为b，现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，统计母本植株的结实率，结果如表所示：

杂交编号	亲本组合	结实率
a	♀BB×♂bb	0.1
b	♀bb×♂BB	0.5
c	♀BB×♂BB	0.5

①表中数据表明B基因失活后使配子育性降低。

②让杂交a的F₁给杂交b的F₁授粉，得到F₂。为验证F₂植株的基因型，研究者据B基因、T-DNA的序列设计了3种引物，如图所示：

随机选取F₂植株若干，提取各植株的总DNA，分别用“引物I+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否能扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR扩增）

如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为。

如果，则相应植株的基因型为BB。

金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过获得用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4） PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有（填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。

大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是（）

A . 两轮PCR过程中退火时的温度不一样 B . 单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组 C . 第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 D . 利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程

PCR技术的基本操作和应用 知识点

4.实验操作 (1)PCR反应体系：

PCR技术的基本操作和应用 知识点题库

PCR技术的基本操作和应用知识点

4.实验操作
(1)PCR反应体系：

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