测定某种微生物的数量知识点

测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
两种计数方法的比较：

项目	间接计数法(稀释涂布平板法)	直接计数法(显微计数法)
原理	当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌	利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式	每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数	每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10⁴×稀释倍数
缺点	当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落	不能区分细胞死活
结果	比实际值偏小	比实际值偏大

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下列有关生物技术实践的叙述，不正确的是（）

A . 在土壤中分解尿素的细菌的分禽和计数实验中，应采用平板划线法 B . 制作果醋时应不断通入无菌空气 C . 通过比色法来检测亚硝酸盐含量需要制备标准显色液 D . 利用DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同提取DNA

如图所示是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列．

（1）图中选择培养基应以为唯一，鉴别培养基还需添加作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成色；
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为10⁵的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191．该过程采取的接种方法是，每克土壤样品中的细菌数量为×10⁸个，与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较；
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为，突变基因表达的蛋白含个氨基酸．

自然界中的微生物往往是混杂生长的．人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定．下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题．步骤如下：

（1）制备稀释倍数为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶的系列稀释液．为了得到更加准确的结果，你选用（填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”）接种样品．
（2）适宜温度下培养．
①为测定大肠杆菌数，在对应稀释倍数为10⁶的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是．
A．一个平板，统计的菌落数是23
B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24
C．三个平板，统计的菌落数分别为21、5和52，取平均值26
D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25
②一同学在对应稀释倍数为10⁶的培养基中，测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL）．
③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量，原因是．

酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：

（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的，及时对培养基进行分装，并进行灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约（在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上色细胞的个数应不少于，才能达到每毫升3×10⁹个活细胞的预期密度。

酵母菌按照不同分裂方式分为多种类型，其中一种为芽殖酵母，是以出芽方式进行分裂（如右图所示）。其中纺锤体的两端为纺锤体极体。芽殖酵母细胞分裂过程属于封闭式，即在细胞分裂时，细胞核核膜不解体。下列叙述错误的是（）

A . 与细胞核分裂直接相关的纺锤体位于细胞核内 B . 芽殖酵母为不均等分裂，由芽体逐渐形成的子细胞体积较小 C . 芽殖酵母计数时，若芽体体积超过细胞体积的 1/3则算独立个体 D . 根据芽体的大小比例可粗略估计细胞所处的时期

下列有关利用稀释涂布平板法对土壤中微生物进行计数的相关说法，不正确的是（　　）

A . 相同稀释倍数的样液至少涂布三个平板才能保证结果的准确性 B . 将不同稀释度下计算的菌落数求平均值得到较为准确的菌落数 C . 本实验需要做一个接种无菌水的对照组以提高实验结果的可信度 D . 土壤中真菌的数量比细菌的数量少，所以真菌的稀释倍数要比细菌小

2019 年 12 月以来，新型冠状病毒导致的肺炎在世界范围爆发。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。经科学工作者研究，发现了数种快速检验新冠肺病原体的方法，以正确诊断。下列与新型冠状病毒的研究、诊断有关的说法中正确的是（）

A . 镜检法：在光学显微镜下直接观察病人的痰液或血液，以发现病原体 B . PCR 技术：体外基因复制技术，可在几十分钟内把病原体的基因扩增到数百万倍 C . 抗原－抗体法：用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合，确认病人是否感染过病原体 D . DNA 探针技术：用放射性同位素、荧光因子等标记的 DNA 分子做探针，利用 DNA分子杂交原理来检测病原体

微生物培养技术在医疗、农业生产等方面均有应用。烧伤病人容易感染绿脓杆菌，临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。请回答下列相关问题：

（1）适于绿脓杆菌生长的培养基中的营养成分一般含有、、水和无机盐，除了提供以上几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对、特殊营养物质以及氧气的要求。
（2）可采用稀释涂布平板法对绿脓杆菌进行分离计数，原理是，统计平板上的菌落数，即可推测出样品活菌数；计数结果往往比实际活菌数低，是因为。
（3）对培养基进行灭菌后，待培养基冷却至50℃时，需要在附近倒平板。接种时所用的接种环在接种前后都需要通过法灭菌。
（4）将分别含等剂量不同抗生素的相同大小的小滤纸圆片均匀置于该平板上的不同位置，在适宜条件下培养一段时间，结果滤纸片周围均出现透明圈，这说明绿脓杆菌对实验所用抗生素表现为填（“敏感”或“不敏感”）。

下列有关实验的分析，错误的是( )

A . 从土壤样品中分离出分解尿素的细菌时需要用到选择培养基 B . 制作腐乳时加盐过多，会导致腐乳过硬、影响口味 C . 利用血细胞计数板进行酵母菌计数时，统计值比实际活菌数多 D . 固定化酵母细胞时凝胶珠在CaCl₂溶液中浸泡时间过长，会使固定细胞偏少

下列关于高中生物实验的表述，正确的是（）

A . 鉴定还原糖与蛋白质所用试剂及操作相同 B . 可以用平板划线法测定土壤中微生物数量 C . 光合色素分离和花生子叶中脂肪鉴定均需显微观察 D . 测定亚硝酸盐含量需配制标准溶液显色后进行比色

硝基苯酚是工业污水中的重要污染物，某同学欲从污水处理厂污泥中分离分解硝基苯酚的细菌。请回答下列有关问题：

（1）为了筛选污泥中可分解硝基苯酚的细菌，在配制培养基时应选择（填“硝基苯酚”“硝基苯酚+牛肉膏”或“硝基苯酚”+葡萄糖）作为碳源，不采用其他两组的原因是。
（2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。分析造成第二划线区域的第一条线无菌落的可能原因是。
（3）进行梯度稀释时的一般操作是将1mL菌液移入mL的无菌水中；常用法接种进行活菌计数，其原理是，但统计的菌落数往往（填“多于”或“少于”）稀释液中的活菌数，原因是。
（4）实验数据显示，当培养基中加入碳源葡萄糖时，该细菌降解速率明显提高，原因可能是。

小球藻是一种单细胞绿藻，是生物学研究的常用材料之一下列说法错误的是（）

A . 可用血细胞计数板对水中小球藻进行计数 B . 小球藻细胞分裂旺盛，可用作观察有丝分裂的材料 C . ¹⁴C标记的¹⁴CO₂可用来探究小球藻光合作用时碳的转移途径 D . 用¹⁸O分别标记H₂O和CO₂做对比实验，可探究光合产物氧气中氧的来源

下列关于高中生物实验方法和选材的表述，正确的是（）

A . 可用斐林试剂鉴定橙汁中还原糖的含量 B . 稀释涂布平板法可用于测定土壤中细菌、霉菌的种类和数量 C . 哺乳动物血液和植物菜花都不宜作为 DNA 粗提取的实验材料 D . 洋葱鳞片叶内表皮没有颜色干扰，适宜用于观察染色体数目

苯酚是含酚工业废水的主要成分，具有致癌、致畸和致突变作用。某污水处理厂检测出要处理的废水中含有较高浓度的苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员欲从淤泥中筛选出能高效降解苯酚的菌株，筛选的主要步骤如下图所示，回答下列问题：

（1）培养基甲和乙营养成分相同，都要加入作为唯一的碳源，甲中还加入了使其与乙物理性质不同；甲、乙两种培养基按用途划分，均属于培养基。
（2）图中振荡培养的目的是。将C培养基中的菌液稀释并涂布在平板上，经过一段时间的培养，在平板上长出一些形态、大小和颜色不完全相同的菌落，这说明。涂布平板后，通常要将甲倒置培养，目的是防止，还能防止培养基中的水分过快挥发。
（3）用涂布平板法统计苯酚降解菌的数目，为了保证结果准确，应选择菌落数为的平板计数。在统计菌落数目时，一定要选取菌落数目稳定时的记录数据作为结果，可以防止。
（4）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的苯酚超过某一浓度时，细菌对苯酚的降解量反而下降，其原因可能是。
（5）分离纯化所得菌种如需长期保存可采用的方法。

假单胞菌是一种革兰氏阴性杆菌，其产生的天然代谢产物申嗪霉素是一种绿色农药。下列关于假单胞菌的培养错误的是（）

A . 应使用中性偏碱的LB培养基培养假单胞菌 B . 用比浊计可对假单胞菌培养液进行活菌计数 C . 用G6玻璃砂漏斗抽滤可实现假单胞菌与申嗪霉素的分离 D . 假单胞菌培养结束后，培养基应先高压蒸汽灭菌再丢弃

下列调查活动或实验中，计算所得数值与实际数值相比，可能偏大的是（）

A . 用标志重捕调查鱼数量时，第一次用大网眼捕捞做标记，第二次还用大网眼捕捞 B . 用血球计数板计数酵母菌数量时只统计方格内的菌体 C . 样方法调查蒲公英的种群密度时在分布较密的地区取样 D . 调查某遗传病的发病率时以患者家系为调查对象

为了探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化，某兴趣小组按下表完成了有关实验。该兴趣小组将酵母菌接种到装有10mL液体培养基的试管中，通气培养并定时取样计数，然后绘制增长曲线。图甲是小组成员用血细胞计数板观察到的培养结果（样液稀释100倍，血细胞计数板规格为1mm×1mm×0.1mm），图乙曲线A、B是两批次酵母菌培养的结果，图丙表示根据每天统计的酵母菌的数量，计算其λ值（λ=当天种群个体数量/前一天种群个体数量）并绘制的曲线。回答下列问题。

试管编号	培养液/mL	无菌水/mL	酵母菌母液/mL	温度/℃
A	10	-	0.1	28
B	10	-	0.1	5
C	-	10	0.1	28

（1）该实验的自变量有。
（2）在取样前应轻轻试管。制片时应该在盖盖玻片（填“前”或“后”）滴加样液。
（3）在计数前，采用台盼蓝染液染色；若细胞被染成蓝色，则（填“需要”或“不需要”）计数。计数时，若图甲只有双边线内有4个细胞为蓝色，此时试管中酵母菌数量约为个。
（4）比较图乙中t₁时，两批次培养的A、B两个种群的增长速率、种内斗争的强度依次是、。（填“A>B”“A=B”或“A＜B”）。
（5）图乙中，t₂时两批次培养液中营养物质的剩余量（填“相同”或“不同”），可能的原因为。
（6）图丙中，下列说法正确的是_____。

A . a→b段，种群数量逐渐增多 B . d点时种群数量达到最大 C . b→c段，种群数量逐渐减少 D . a点和c点的种群数量不同

下列有关说法不正确的是（）

A . 探究果胶酶最适用量的实验中可先将果泥加热煮沸后冷却备用，目的是排除果泥中原有的酶对实验结果的干扰 B . 探究温度对酶活性的影响的实验中，将酶溶液加入底物后，迅速将温度调至设定的温度，并持续反应一段时间 C . 采用稀释涂布平板法计数某种细菌的原理是，当样品稀释度足够高时，固体平板上的一菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，故可通过平板上的菌落数推测样品中的活菌数 D . 用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上

饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答。

（1）培养基中除了添加以外，应含有碳源、氮源、水、无机盐等基本营养物质。为防止杂菌污染，要对培养基进行法灭菌。
（2）统计平板上的菌落数，就能大致推测出样品中的活菌数。通常每种稀释液需涂布3个平板，取其平均值，若将最后一个试管中的菌液每次吸取0.1mL涂布培养后获得平均值是a，则1g土壤中含有此菌的菌株数是。
（3）若要对上述菌株进行纯化，通常使用的划线工具是；接种时，在第一区域划线后须将该工具后再划线，在第二次划线时须从第一次划线的末端开始，这样做的目的是从上一区域获得菌种。
（4）下图表示培养和纯化产植酸酶的菌株的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是____。

A . 步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置 B . 步骤②接种环火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后划线 C . 步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落 D . 步骤④恒温培养箱培养后可用来对菌株进行计数

回答下列（一）（二）小题。

（1）
（一）有文章称单位面积手机表面的细菌比马桶按钮上的多。某校甲、乙两研究性学习小组通过如图所示实验展示调查结果。

实验使用的培养基，含有营养物质和。制备培养基时，应将pH调至。图中继续实验中可能包含的实验操作有、、。
（2）通过观察菌落的特征可知，手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物。两研究性学习小组实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同。你认为可能的原因是。
（3）实验中，两研究性学习小组采用的接种方法是。按图示操作取样固定实验员欲测定某手机屏幕的细菌数量，将10mL细菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1mL稀释倍数为10²的样品液接种到三个培养基上培养一段时间后，统计菌落数分别为38、40、42，则该手机屏幕的细菌数为个/cm²。
（4）（二）回答下列有关基因工程的问题：

I．研究人员将某细菌的抗虫基因C转入棉花细胞内，成功获得了抗虫转基因棉花，在一定程度上减少了杀虫剂的使用，减少了环境污染，提高了作物的产量和质量。
提取某细菌总RNA，经逆转录形成互补的DNA（cDNA），再利用PCR技术选择性扩增C基因的cDNA，PCR过程中DNA先后经历高温变性→复性→延伸过程，故反应体系中需加入酶。
（5）常用农杆菌与经后的外植体共培养一段时间完成转化，需先将C基因的cDNA插入到T质粒的T-DNA上并导入农杆菌，有利于。若要检测目的基因是否反向插入，（填“能”或“不能”）根据带标记的目的基因单链作探针的核酸分子杂交结果判断。
（6）
Ⅱ．基因编辑技术（CRISPR/Cas9技术）是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA（sgRNA）分子引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割（如图）。请据图回答：

从CRISPR/Cas9系统作用示意图看，能够行使特异性识别DNA序列并切割特定位点功能的分子是。一般来说，在使用基因编辑工具对不同DNA进行编辑时，应使用Cas9和（填“相同”或“不同”）的向导RNA进行基因的相关编辑。
（7） CCR5基因是人体的正常基因，其编码的细胞膜通道蛋白CCR5是HIV入侵辅助性T淋巴细胞的主要辅助受体之一。科研人员依据的部分序列设计sgRNA序列，导入骨髓造血干细胞中，构建sgRNA-Cas9复合体，以实现对CCR5基因的定向切割，变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，即可有效阻止HIV侵染新分化生成的从而有效减缓病症。

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